基因修饰动物：恩泽世界的幕后英雄
►目前，最有潜力打入医疗市场的基因修饰哺乳动物是猪。图片来源：flickr
编者按：
转基因作物的各种流言甚嚣尘上生生不息，世人却鲜闻基因修饰动物。其实，基因修饰动物这类技术已经发展了四十多年，默默在各个领域发挥着巨大的作用。
撰文 | 唐骋（中科院上海神经科学研究所博士生）
责编 | 程莉
● ● ●
提到转基因，或者基因修饰之类的术语，十个人脑中怕是有九个所想到的，都是那些在网上激起无数口水仗的各类转基因农作物。然而，人类制造种类最多、基因操作最复杂并且对这个世界贡献最大的基因修饰生物恐怕并不是那些在农业领域掀起变革的植物，而是动物。
基因修饰动物看似鲜为人知，其实无处不在。
病毒：
基因修饰动物的第一枪
我们已经知道，人类身上大约有5-8%的基因源自于病毒。事实上，不止人类，在目前所知的几乎所有动物身上都发现了来自于病毒的基因成分[1]。病毒就像是一个个运送基因的“快递小哥”，但病毒可不像一般的快递小哥那样遵纪守法，它说要把基因塞给细胞，细胞就非得接受不可。而这些强塞给细胞的基因中有一部分可以 “幸运地”嵌入到生殖细胞或早期胚胎的基因组中，从而世世代代流传下去。
这其中的一些病毒基因甚至能反客为主，变成宿主不可分割的一部分。比如说人类怀胎十月，母体的免疫系统居然在那么长的时间里都不排斥庞大的胎儿，这里面就有内源性病毒基因的功劳。生物在演化的漫长历程中遭遇过无数病毒的感染，便点点滴滴地纳入了无数病毒基因，将一次次偶然的感染铭刻到了这个物种的血脉之中，也一点一点地改变了自身，让我们成了现在这个样子。
大自然能做到的，人类往往能更加高效地做到，这就是科技。
1974年，美国两位科学家碧翠丝·明茨（Beatrice Mintz）和鲁道夫·耶内施（Rudolf Jaenisch）受此启发，他们将人工提纯的高浓度病毒注入小鼠囊胚，成功地将病毒基因整合进了小鼠的基因组，这是人类历史上第一次通过生物技术手段获取基因修饰过的动物[2]。
►利用胚胎病毒注射法获取基因修饰动物的一般流程（以小鼠为例）。图片为作者自制。
病毒本身结构简单，容易改造，人们既可以消除病毒的侵染性，让病毒完成传递基因的使命后便功成身退，不再能继续感染；更可以在病毒的基因组中掺杂进自己的私货，让病毒带着我们想要的基因侵染动物，从而将指定的基因转入动物体内。理论上，利用特殊改造的病毒既可以把人类所选择的任何基因转入动物体内，而对于基因修饰动物自身以外的动物和人不会有任何风险。
►利用胚胎病毒注射法获得的绿色荧光小鼠。图片来源：上海南方模式生物研究中心
但是病毒并不是个足够完美的工具。既然是运送基因的快递，病毒的“包裹容量”总是有限的，就像你网购点吃喝玩乐的小东西没啥问题，但要是哪个土豪想买艘游艇，那恐怕就没哪个快递小哥可以胜任了。事实上，动物大多数基因对病毒而言都过于巨大，无论“打包”得多么精巧也不可能塞进病毒那小小的外壳当中。
此外，病毒不但会强迫细胞接收快递，送起快递来还特别暴力，它总是不顾三七二十一地把DNA片段随便插入到宿主基因组中，插在哪里，插入多少都只能听天由命，甚至还可能因为“暴力操作”而损坏细胞原有的基因组，这也是某些病毒特别容易引发癌症的原因之一。因此尽管直到今天我们偶尔还是会像当初那样，直接把病毒注入胚胎（或受精卵）来制作基因修饰动物，但是这类技术太过粗糙，注定不能满足现代对基因修饰动物的大部分技术要求。
胚胎干细胞体外培养：
真正的动物基因修饰技术
事情到了1981年才迎来转机，那年剑桥大学的生物学家马丁·埃文斯爵士（Sir Martin John Evans）与马修·考夫曼（Matthew H. Kaufman）[3]，和美国加州大学教授盖尔·马丁（Gail Roberta Martin）[4]几乎同时发明了小鼠胚胎干细胞的体外培养技术。
胚胎干细胞是个神奇的东西，它可以变化成生物个体全身上下任何一种体细胞。虽然胚胎干细胞没法像受精卵一样直接发育成一个动物个体，但是科学家发现，如果把胚胎干细胞注入到早期胚胎当中，这些胚胎干细胞就会像滴入清水中的墨水一般“掺”进胚胎当中，与胚胎原有的细胞混在一起，你中有我，我中有你，再也分不开了。最后就会生出一个包含两种来源细胞的“混合个体”，这种动物体内一部分细胞来自原来的那个早期胚胎，还有一部分则来自科学家注入的外源性胚胎干细胞，两拨细胞虽然非亲非故，但是却可以在一只动物体内和谐共处，我们一般称这样的动物为“嵌合体”。
►不同毛色小鼠的胚胎干细胞掺在一起而产生的嵌合体小鼠。图片来自维基百科
这样一来，科学家可以先在培养皿中培养胚胎干细胞，然后再利用病毒等工具对这些胚胎干细胞进行基因操作。由于胚胎干细胞是一种像癌细胞一般的“不死”细胞，所以如果需要转入的基因太大，就可以把基因拆分成几份，分多次转入细胞。不但如此，科学家还可以从成千上万的胚胎干细胞当中筛选出基因操作效果最好、最贴近科学家目标的那一个细胞拿出来单独培养、复制，然后将这些经过基因修饰的胚胎干细胞注入动物胚胎当中，即可得到含有基因修饰过的细胞的嵌合体。
[注]除了病毒以外，我们还有诸如钙转法、脂质体法、微囊泡融合法等工具，不过这些工具的目的和病毒一样，都是把外源性基因转入细胞内部，因此就不多作赘述了。
►利用囊胚注射法获取基因修饰动物的一般流程（以小鼠为例）。图片为作者自制。
1985年，英国科学家奥利弗·史密斯（Oliver Smithies）率先推出一种被称为“同源重组”的技术，实现了对基因的精确编辑[5]。之后在1986年，美国科学家马里奥·卡佩基（Mario R. Capecchi）结合胚胎干细胞体外培养技术和同源重组技术，制造出了世界上第一只精确基因编辑的小鼠[6]。
虽然这类精确基因编辑往往效率极低且成本高昂，但这毕竟是人类从粗糙的“转基因”跨入精确的“基因编辑”的第一步。2007年，因为在基因编辑上的突破性工作，马里奥·卡佩基、马丁·埃文斯爵士和奥利弗史密斯共同获得了当年的诺贝尔生理学或医学奖。
直到现在，利用胚胎干细胞囊胚注射依然是制造小型基因修饰动物的主流方法之一，几乎每个基因学实验室里都会有用此方法制作的基因修饰小鼠。然而嵌合体受制于技术，体内含有两种不同来源的细胞，其中几乎必然有一部分细胞不带有科学家所需的基因修饰，所以人们一般需要将其杂交几代后才能真正获得想要的动物个体，对于生育周期很长而且生育个数少的哺乳动物而言，这种技术还远远不够。比方说如果用这种方法制造一群基因修饰牛，恐怕需要十年乃至更长的时间，显然无论是商业还是科研都很难承受这样的时间成本。
克隆：
基因修饰大型动物的新时代
终于到1996年，苏格兰一只名叫“多莉”的小羊解开了这个死结，也让世人无不听说了一种叫做“克隆”的新技术。克隆技术能够把一颗细胞直接变成一个动物个体，大大缩短了基因修饰动物的制作周期。如今，世界上绝大多数基因修饰的猪狗牛羊等大型动物都是用这种方法制作的。例如我国的畜牧业专家赖良学就曾经领导团队用克隆技术制造出了抗猪瘟的基因修饰猪。
►利用克隆获取基因修饰动物的一般流程（以小鼠为例）。图片为作者自制。
至此，那位坏坏的“快递小哥”终于在各种科技加持下“从良”了。
CRISPR/Cas9系统：
史上最强的基因编辑工具
病毒之类的工具的终究是“快递小哥”，它们只是负责把快递送到细胞内而已，所以要给细胞内塞点基因进去不难，但是若想要精确删除或者修改细胞内的基因就没那么容易了。那么如何才能让快递小哥兼职“裁缝”呢？
2012年，来自加州大学的詹妮弗·杜德娜（Jennifer Doudna）[7]和来自麻省理工大学的张锋[8]各自设计出了一种极为强大的基因编辑工具CRISPR/Cas9系统。这个系统可以按照设计者的意愿进入细胞核内，对细胞的基因组进行增加、删除以及修改等一切编辑操作。CRISPR/Cas9系统的强大是跨越时代的，从此CRISPR/Cas9系统近乎成了基因编辑的代名词。
这下事情就好办了，只要把“快递小哥”包裹中的基因换成CRISPR/Cas9系统，那么科学家就可以随心所欲地编辑基因了。这就好比直接把一个智能机器人快递给细胞，只要快递小哥准确送货到家，接下去的工作只要交给这个智能机器人便可以了。2014年，当初制造出世界上第一只基因修饰动物的科学家鲁道夫·耶内施时隔四十年后又在其实验室中制造出了第一只利用CRISPR/Cas9系统创造出的基因修饰动物[9]。
►基因修饰动物的先驱，鲁道夫·耶内施。图片来自维基百科。
如今，CRISPR/Cas9系统、胚胎干细胞体外培养技术和克隆技术已是制造基因编辑动物的三大支柱技术。终于，科学家远远走在了大自然的前面，可以近乎随心所欲地编写动物的基因组了。
神兵既出，接下去就要看看其锋芒了。
幕后的医疗变革推手
与基因修饰的植物不同，基因修饰动物在农业方面的应用极少，唯一值得一提的大概是美国FDA批准了一种生长较快的转基因三文鱼进入市场[10]，这是迄今为止唯一被批准上市的食用基因修饰动物。这一点并不难理解，民众对转基因农作物尚且有这么大反应，就更别提这些还有着动物伦理、人畜共患病等一大堆“死结”的基因修饰家畜了。但从另一方面来说，基因修饰动物的主要价值也并不在农业上，这是基因修饰动物产业依然蓬勃发展的内在原因，而这同时也让基因修饰动物不容易进入民众视野，得以躲避舆论的喧嚣。
数十年来，绝大多数实验室制造基因修饰动物模型都是出于科研目的。我们制造出癌症、老年痴呆和糖尿病动物模型，大大加速了临床医学的发展；我们有针对性地减少或增强某些基因的效果，从而得以从分子级别上理解各种基因的意义；我们将某些动物基因替换为人类基因，制造出“人源化”动物模型，从而让这些动物可以患上人类疾病，并能对各种药物产生与人类更加类似的反应，从而规避人体试验的风险。此类种种，经过科学家数十年的辛勤劳作，带来了不计其数的新型治疗手段和重大科研突破。
►肥胖症小鼠模型（右）与正常小鼠（左），通过基因编辑可以让小鼠变得“喝口凉水都长肉”，我们现在之所以能知道肥胖的成因以及对身体健康的种种影响，很大程度上就是依靠对这类小鼠的研究。图片来源：上海南方模式生物研究中心
而今，因为CRISPR/Cas9为代表的新一代基因编辑技术的发明，我们能够对基因施以更加精细更加复杂的操作，这一切正在启动着医疗技术新一轮的革命。 通过对基因修饰动物的反复研究，基因治疗已经不再是一个科幻小说中的概念。
杜兴氏肌肉萎缩症（Duchenne Muscular Dystrophy）曾经是一种无药可救的恶性遗传疾病，患病者由于自身的基因缺陷，从出生开始就会遭遇不可逆转的肌肉萎缩，最终在很年轻的时候因呼吸肌衰竭窒息而死。但是在2016年初，来自三个机构的多个研究组通过将含有CRISPR/Cas9系统的病毒注入患有杜兴氏肌肉萎缩症的动物体内，结果成功地修复这些动物有缺陷的基因，继而大大提高了它们的预期寿命和生活质量[11[12][13]。
甚至对于某些疾病的治疗技术已经完成了动物实验，迈进了临床阶段。就在不久前，斯坦福大学的科学家发明了一种新技术，可以将患有镰刀型细胞贫血症（sickle-cell disease）患者的造血干细胞抽出来，在培养皿中用基因编辑技术加以修复，然后回输给患者[14]。借由这样的“换血”，对这种绝症的治疗已即将成为人类医学历史上的另一场漂亮的硬仗。
除此以外，还有多种严重遗传病，乃至后天性的肿瘤、心脑血管疾病和神经退行性疾病都在被征服的路上。可以说，基因修饰动物已经在延长世界上每一个人的预期寿命，而你我都会是这次医学革命的受益者。
生于科技，胜于科技
对于任何国家而言，器官移植都是极为棘手的问题。其实不止是器官，任何来自于人体的生物成分都面对着同样的问题，对血浆、白蛋白、免疫球蛋白等等无穷无尽的需求与捉襟见肘的供应，让无数病患在煎熬的等待中结束了生命，更让器官黑市和地下血站成了人类文明社会的毒瘤。
然而，基因修饰动物正在让这一切成为历史。
2014年，中国科学家张普民和他的研究团队利用基因编辑技术，成功制造出了能够产生人类白蛋白的转基因猪[15]。而来自美国哈佛大学的杨璐菡团队则更进一步，他们采用大规模基因编辑技术，试图让经过基因编辑的猪直接产生人类的器官[16]。但毕竟临床医学对安全性和有效性有着异乎寻常的严格标准，所以这些正在研发中的技术还有很多瓶颈需要突破。然而曙光已经出现在地平线上了，如今，拥有这些技术专利的企业已经获取了数亿美元的风投和政府资助，这场变革也许会在我们有生之年悄然而至。
在某些领域，基因修饰动物已经让动物超越了“动物”的概念，变成了某种“生物反应工厂”。我们将大肠杆菌等微生物作为“生物反应工厂”已有数十年的时间，但微生物毕竟个体小，又比较“娇气”，使用起来不但需要构造复杂的发酵罐，从中提取其生物反应产品也需要费一番功夫。
如果将动物用于生物反应，情况将大有改观。动物不但饲养容易，更重要的是，提取来源于动物的生物反应产品会更加容易。中国人养蚕已经有好几千年的历史了，我们可以从蚕宝宝身上获取我们所需的蚕丝，每条蚕可以产生大约一克蚕丝，而蚕丝的成分则是纯度高达80%以上的蚕丝蛋白。试想一下，如果我们修改了蚕的基因，让它吐出的不是蚕丝蛋白而是人类的免疫球蛋白，甚至是更昂贵的单抗药物蛋白，那意味着一条蚕的产量就足以把一万个癌症病人从死亡线上拉回来，那世界将会变成怎样一副光景？
事实上，这并不是想象，目前全世界已经有无数家公司和研究机构正在着手开始这方面的研究了。
机遇，风险与未来
任何一个生物技术的从业人员都明白，生命技术的大规模产业化就在眼前，这必将带来极其巨大的财富与汹涌澎湃的经济结构转变，科学家，企业家都将在这场经济结构转型的浪潮中成为冒险家。然而机遇与风险乃至乱象从来都是不分家的。
与被放在聚光灯下接受无数人审视的转基因作物不同，基因修饰动物的商业化反而处于一种近乎“野蛮生长”的状态，各种投机之下难免出现很多资本胡乱扩张的问题。去年，天津市某生物技术公司高调宣布要建设“全球最大的克隆工厂”，不但要生产各种商业化的克隆动物与基因修饰动物，甚至还宣称要短期内攻克灵长类克隆之类的世界性难题[17]。结果不到半年时间，这个雄心勃勃的计划便在一片质疑中成了个烂尾工程。
而反观政府这边，世界则陷入了两种不同的极端。中国和美国至今也没有公布足以规范基因修饰动物市场的行业规范，欧洲议会则干脆宣布彻底禁止任何克隆动物的商业化，这实际上也禁绝了基因修饰大型动物的商业运作。对于一个新兴的产业，无论是放任自流还是一刀切式的懒政，恐怕都不是合理的做法。
技术也好，资本也罢，一切都是中性的，无所谓善恶，而能够决定其善恶的终究是站在这一切背后的人类，我们。面对一个前所未有的事物，我们没有任何经验可遵循，而每每这种时候，却是考验我们智慧的时代节点，正是这种智慧，让我们人类文明成功发展到了今天。
生命之路，道阻且长，让我们拥抱那光明的未来，也让我们留心那暗藏的荆棘。
参考资料：
1. Belshaw R, Pereira V, Katzourakis A, Talbot G, Paces J, Burt A, Tristem M (April 2004). "Long-term reinfection of the human genome by endogenous retroviruses". Proc Natl Acad Sci USA. 101 (14): 4894–9.
2. Jaenisch R, Mintz B (1974). "Simian virus 50 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (4): 1250–1254.
3. Evans, M. J., & Kaufman, M. H. (1981). Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. nature, 292(5819), 154-156.
4. Martin, G. R. (1981). Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 78(12), 7634-7638.
5. Smithies O, Gregg, R. G., Boggs, S. S., Doralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature. 1985;317:230-4..
6. Thomas KR, Folger, K.R., Capecchi, M.R. High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome. Cell. 1986;44:419-28
7. Charpentier, Emmanuelle, and Jennifer A. Doudna. "Biotechnology: Rewriting a genome." Nature 495.7439 (2013): 50-51.
8. Zhang F et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. (2013) Science 339(6121): 819-823
9. Yang H et al. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. (2014) Cell
10. http://www.guokr.com/article/440946/
11. Nelson et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science DOI: 10.1126/science.aad5143
12. Long et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science DOI: 10.1126/science.aad5725
13. Tabebordbar et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science DOI: 10.1126/science.aad5177
14. Dever, D. P., Bak, R. O., Reinisch, A., Camarena, J., Washington, G., Nicolas, C. E., ... & Uchida, N. (2016). CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature.
15. Peng, J., Wang, Y., Jiang, J., Zhou, X., Song, L., Wang, L., ... & Liu, J. (2015). Production of human albumin in pigs through CRISPR/Cas9-mediated knockin of human cDNA into swine albumin locus in the zygotes. Scientific reports, 5.
16. http://www.yangtse.com/gd/2015-10-17/677422.html
17. http://world.chinadaily.com.cn/2015-12/04/content_22627081.htm
欢迎个人转发到朋友圈，
公众号、报刊等转载请联系授权
copyright@zhishifenzi.com
▼点击查看相关文章
屠呦呦 | 王晓东 | 白岩松 | 何江 | 张锋 | 杨振宁
▼▼▼点击“阅读原文”，牵手科学队长！